抗體介導的非洲豬瘟病毒中和反應:誤區與事實(中)

來源:養豬職業經理人 時間:2019-10-15 11:00:00 舉報

3. ASFV的體外中和反應機制

Gonzalvo et al., 1986a,b;Zsak et al.,1993)。研究也報道了占總量約10%的病毒存在持續非中和現象。用免疫豬血清抑制同源病毒(或異源病毒)感染豬巨噬細胞的感染抑制測試無法辨別這部分病毒(Ruiz Gonzalvo et al., 1986b)。

用傳統的蝕斑減少中和試驗測量被抗體中和的ASFV存在許多難點,因為許多毒株,尤其是低代次毒株,會出現蝕斑缺失或延遲形成的現象。在病毒自然宿主細胞豬巨噬細胞中進行中和試驗時,會遇到更多的問題。因此大多數作者采用高度適應細胞系的毒株進行中和試驗,下一章將對這點進行深入討論,因為這對結果有重要的影響。為了克服這個問題,研究者開發了表達顯色標記基因如β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的基因修飾病毒(Gómez-Puertas et al., 1995),用于對ASFV抗體中和機制的深入研究。無論這些在細胞培養中是低代次還是非傳代,都可以用于中和試驗,且實驗用時不到非修飾病毒的三分之一;通過顏色對比可以更準確地檢測小蝕斑;可用于比較病毒在原代細胞和細胞系上的不同中和效果。

上述表達標記基因的重組病毒已被用于一系列關于感染減毒病毒的康復豬體內是否存在中和抗體的研究中(Gómez-Puertas et al., 1996)。這些豬的高溫滅活血清降低了幾種細胞培養低代次病毒87-100%的感染性。如前所述,部分病毒(4-13%)存在非中和現象(Ruiz Gonzalvo et al., 1986a;Zsak et al., 1993),在其它囊膜病毒中也發現了這種現象(Ashe and Notkins, 1967;Jackson et al., 1991;Poumbourios et al., 1990)。中和抗體的誘導產生可能出現在減毒病毒感染早期,在大多數情況下,感染后9天的康復豬血清可以中和病毒50%以上的感染性。免疫豬的中和抗體在感染后的第二周周末到達平臺期(Gómez-Puertas et al., 1996)。

減毒疫苗免疫豬體內的抗體至少使用兩種機制中和病毒在細胞系和巨噬細胞原代培養中的感染性。病毒與Vero細胞或豬肺泡巨噬細胞的結合存在飽和機制(Alcami et al., 1989),反應開始后120-240分鐘達到平臺期(Gómez-Puertas et al., 1996)。4℃(病毒內化被抑制)條件下,在病毒吸附細胞前后添加抗體,可以探究抗體對病毒吸附的阻斷作用(圖2A)。病毒與易感細胞的結合抑制與病毒中和有相關性。用放射性元素標記的病毒進行實驗,無論是在Vero細胞還是在巨噬細胞中,當無中和抗體對照組細胞結合病毒量達到最大時,ASFV免疫血清組的細胞結合病毒量較對照組減少80%以上(Gómez-Puertas et al., 1996)。平行中和實驗表明,免疫血清降低了病毒90%以上的感染性。說明ASFV中和機制的其中一條是抗體抑制病毒與細胞的結合。

另一條ASFV中和機制通過用免疫血清抑制病毒內化(圖2B)的實驗得以證明。在4℃讓病毒吸附細胞后,分別添加對照血清和中和血清孵育,去除血清后,培養溫度恢復到37℃讓病毒在無血清條件下內化4h,最后用蛋白酶處理得到未內化病毒粒子。對照組病毒內化未受影響,而添加中和血清的實驗組,90%以上的病毒從細胞表面脫落下來(Gomez-Puertas et al ., 1996)。用Vero細胞與豬巨噬細胞進行上述實驗,結果無顯著差異。這些觀察揭示了第二種ASFV中和機制,該機制破壞了病毒復制周期第二步中涉及病毒內化的過程。

  

圖2 ASFV中和機制的確定。(A)放射標記ASFV的細胞吸附經對照血清和免疫血清孵育后的抑制百分比。(B)內化抑制實驗中經蛋白酶K處理后脫離Vero細胞的病毒百分比。

用ASFV進行的實驗不能像其他病毒模型那樣(Sune et al., 1990),可以分辨在不同抗體-病毒比例下可能占主導的機制。然而,在本病毒模型的條件下,這兩種機制的效率幾近相同。約80%的病毒與細胞的結合被抑制,超過90%的病毒在中和抗體存在的情況下無法內化(Gomez-Puertas et al., 1996)。這兩種機制的組合可以抑制了95%以上的病毒感染。總之,ASFV的中和作用可能源于病毒復制周期受到抑制,抑制作用至少發生在兩個步驟,分別為病毒吸附和內化。

4. 影響 ASFV 中和反應敏感性的因素

過去,研究者認為ASFV不能被抗體中和(Hess, 1981;Vi nuela, 1985)。有趣的是,Zsak et al .(1993)的一項研究表明,感染ASFV E75株的康復豬血清可以中和Vero細胞和巨噬細胞培養的多個高毒力ASFV毒株(E75、E70、Lisbon 60、Malawi Lil 20/1)和適應組織培養的低代次毒株86-97%的感染性,但未能中和適應組織培養高代次毒株(Lisbon 60、Haiti、Dominican Republic I、Dominican Republic II和Brazil II)。用可以與所有病毒反應的單克隆中和抗體(135D4)進行的實驗也得到了類似的結果。據此,作者提出,ASFV毒株的組織適應性與病毒中和相關特質的丟失有關。

ASFV在細胞系中的增殖會改變病毒遺傳和表型的一些關鍵特性,例如在自然宿主細胞豬巨噬細胞中的復制能力(Alcaraz et al., 1992;Rodriguez et al., 1994)。但不是所有在細胞系中增殖的病毒都會出現中和相關抗原構象的巨大改變。后來的一項研究(Gómez-Puertas et al., 1997)證實,低代次病毒和高代次病毒對中和的敏感性不同(圖3A)。作者證明,敏感性的差異并不是因為關鍵表位的抗原變異,并揭示了敏感性與ASFV病毒粒子磷脂成分的相關性;隨著病毒在細胞培養中代次的增加,磷脂成分發生了變化。對低代次病毒和高代次病毒細胞膜磷脂成分的比較分析發現,這兩組病毒的磷脂酰肌醇相對含量存在差異,且這種差異與用于病毒培養的細胞無關(圖3B)。通過Percoll密度梯度離心沉降法進一步純化低代次病毒和高代次病毒,發現其磷脂組成與之前的結果一致,并驗證了病毒對中和的敏感性。向高代次病毒的囊膜插入磷脂中的主要成分磷脂酰肌醇使其具有類似低傳代病毒的中和敏感性(圖3C),其他磷脂成分則不影響高代次病毒的中和,這表明磷脂酰肌醇對于抗原表位向中和抗體的正確展示至關重要。此外,用特異性脂肪酶去除低代次病毒囊膜中磷脂酰肌醇會使低代次病毒由可中和變為不可中和(圖3C)。這些數據揭示了病毒膜脂質組成對抗體識別蛋白質的重要性,并可能在一定程度上解釋了為什么過去ASFV高代次病毒與中和抗體的實驗難以重現。

考慮到高代次和低代次病毒中和效果的差異,應謹慎選擇用于中和研究的病毒毒株。目前已證實了其他依賴于病毒代次和/或宿主系統的中和案例(Baldinotti et al., 1994;Grady and Kinch, 1985;Kim et al., 1994)。與其他病毒系統一樣(Luan et al., 1995),ASFV可以主導其膜磷脂的組成,因為在同一細胞中培養的低代次和高代次病毒的膜中磷脂的相對比例不同(Gómez-Puertas et al., 1997)。在水貂阿留申病毒中,病毒粒子的脂質組成決定了它們能否被中和(Stolze and Kaaden, 1987)。低代次病毒粒子中存在大量磷脂酰肌醇,說明ASFV的囊膜來源于宿主細胞內質網(ER),新形成的病毒粒子的磷脂組成類似于已知的ER膜組成,且基本上所有磷脂酰肌醇都是在ER中合成的(van Meer, 1989)。與之相反,不可中和的高代次病毒粒子的磷脂組成介于ER膜和之后的分泌部件膜之間(van Meer, 1989)。表明低代次病毒和高代次病毒的膜形成機制不同(Sodeik et al., 1993)。

圖3 ASF病毒粒子磷脂成分與抗體中和敏感性的相關性。(A)用康復豬血清在Vero細胞上進行噬斑減少試驗檢測細胞系培養低代次病毒和高代次病毒的中和敏感性。(B)純化低代次病毒和高代次病毒囊膜磷脂組成,用磷脂酰肌醇的相對含量表示。(C)低代次病毒和高代次病毒經添加(+)或去除(―)磷脂酰肌醇后的中和敏感性。

磷脂對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抗原特性起著至關重要的作用。該蛋白經一組單克隆抗體鑒定得到的所有表位在與酸性磷脂重構后表現出不同反應活性(Gomez-Gutierrez et al., 1994, 1995)。HBsAg蛋白與酸性磷脂之間的靜電相互作用是抗原活性完全恢復的部分原因。作者提出抗原活性依賴于磷脂分子的物理狀態。抗原在細胞膜上形成構象后,各種磷脂與抗原的額外相互作用可能改變抗原性,如HBsAg(Gómez-Gutierrez et al., 1994, 1995)或ASFV中參與中和的表位所示。

未完待續……

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