抗體介導的非洲豬瘟病毒中和反應:誤區與事實(完整版)

來源:養豬職業經理人 時間:2019-10-15 11:00:00 舉報

5. 部分持續非中和病毒

在用大多數康復豬血清進行體外中和試驗的過程中,研究者發現占病毒總量約10%的持續非中和病毒(Gómez-Puertas et al., 1996;Ruiz Gonzalvo et al., 1986a;Zsak et al., 1993)(圖4A)。這部分持續非中和病毒可能是豬群中常見的ASFV持續感染的原因,

即使存在過量的中和抗體,感染性病毒仍然存在。在其他病毒模型中,這部分持續非中和病毒的存在被歸因為以下幾點:形成了無法被抗體捕獲的病毒聚集體(Taniguchi and Urasawa, 1987);血清不能中和大量病毒顆粒(低效價抗血清;Narayan et al., 1984);產生了耐中和突變毒株(Hussain et al., 1987;Lambkin et al., 1994;Li et al., 1995;Watkins et al., 1993);中和抗體親和力低,需要長時間孵育才能實現有效中和(Torfason et al., 1992);抗體-病毒復合物穩定性低,稀釋后易解離(Sune et al., 1990);以及存在抑制病毒中和的阻斷抗體(Massey and Schochetman, 1981;O’Rourke et al., 1988)。

上述大部分假說都在ASF中進行了研究,實驗采用感染減毒毒株的康復豬血清,分別具有完全或不完全的病毒中和能力(Gómez-Puertasand Escribano, 1997)。實驗表明,ASFV的不完全中和可能是由病毒聚集引起的(Zsak et al., 1993),而不是因為病毒-抗體復合物的低親和度或低穩定性。從持續非中和ASFV病毒中純化抗原突變病毒的嘗試也沒有成功。血清間的競爭實驗表明,出現持續非中和現象的血清會阻斷另一種血清介導的完全中和(100%)作用(圖4B)。這些結果強有力地說明,在ASFV感染過程中誘導產生的阻斷抗體可能是中和試驗中持續非中和病毒存在的主要原因之一,也可以解釋為什么康復豬中會出現持續感染。也不能忽略病毒感染相關的其他因素,如細胞與細胞間的病毒直接傳播,會影響抗體介導的中和的病毒量。

  

圖4 康復豬血清中阻斷抗體的存在及持續非中和病毒。(A)用康復豬血清(1-3)進行中和試驗后出現的持續非中和病毒,只有3號血清可以達到100%中和。(B)1號和3號血清的使用順序會影響中和試驗終點的持續非中和病毒量。一孵使用的1號血清會阻斷二孵中3號血清的完全中和作用。說明1號血清中存在阻斷抗體。

6. 介導 ASFV 中和抗體產生的蛋白

復雜病毒通常有不止一個介導中和的外部蛋白,中和的復雜性也因此增加(Dimmock,1993)。通常每個蛋白質都有多個中和位點,而且可能有不同的中和機制。此外,不同蛋白質的中和效率可能不同。識別主要衣殼蛋白 p72 的單克隆抗體 mAb-135D4 表現出較強的ASFV中和活性(Zsak et al., 1993)。免疫電鏡使用mAb-135D4將p72定位于去除囊膜的病毒顆粒表面,與其在病毒中和的作用一致(Borca et al., 1994)。用mAb-135D4對體外表達的 p72進行特異性免疫沉淀分析,確定 mAb-135D4 氨基酸殘基 400-404 之間是反應活性必需區域。覆蓋殘基388-446的5個互有重疊的肽段(15mers)未能與 mAb-135D4反應,說明表位具有構象依賴性(Borca et al., 1994)。

從康復豬血清中發現,p72、p30 和 p54是感染期間最具有抗原性的三種蛋白(Afonso et al., 1992;Alcarazet al., 1990, 1995;Gómez-Puertas et al., 1996;Rodriguez et al., 1994, 1996)。抗 p72、p30和p54重組蛋白的免疫豬血清可以中和病毒70%以上的感染性(Gomez-Puertas et al.,1996)。出乎意料的是,在體外實驗中,病毒吸附蛋白p12重組蛋白(Carrascosa et al., 1995)的抗血清并沒有降低病毒的感染性(Gomez-Puertas et al., 1996)。感染ASFV的Vero細胞進行超薄切片,在免疫電鏡下用血清對細胞內成熟病毒顆粒上三種蛋白的位置進行定位(Gomez-Puertas et al., 1996)。全病毒感染中生成的該三種蛋白的特異性抗體親和純化后,對病毒的中和效果,與三種重組蛋白同時免疫豬誘導生成的特異性抗體一致(Gomez-Puertas et al .,1996)。抗p72和p54血清只有在病毒吸附易感細胞之前才能發揮中和效果。而識別 p30 的血清在病毒吸附細胞前后,都能發揮中和效果(Gomez-Puertas et al., 1996)。因此,我們可以得出結論,抗 p72 和 p54抗體抑制了病毒復制周期第一步的病毒吸附,而抗p30抗體則阻斷了病毒復制周期第二步的病毒內化。與在康復豬血清實驗中觀察到的兩種中和機制對應,并確定了與機制分別相關的蛋白質。

本文還研究了 p54 和 p30 蛋白在豬巨噬細胞中受體介導內吞中的作用。用非離子洗滌劑處理 ASFV 病毒粒子后釋放出兩種蛋白,使其結合在對病毒敏感的豬肺泡巨噬細胞上。這種結合可以被康復豬或經重組p54 或 p30 蛋白免疫豬血清中和抗體特異性抑制(Gomez-Puertas et al., 1998)。放射元素標記的重組 p54 和p30 蛋白與巨噬細胞的結合可被過量的未標記 p54 和 p30 分別競爭取代。但沒有觀察到交叉抑制,這表明兩個蛋白在易感細胞中存在兩個不同的飽和結合位點。此外,p54 阻斷了病毒顆粒與巨噬細胞的特異性結合,而 p30 則阻斷了病毒的內化。這兩種蛋白都能獨立地以劑量依賴的方式抑制病毒感染,表明這兩個蛋白介導的相互作用是形成增殖感染的必要條件(Gomez-Puertas et al., 1998)。

研究者還討論了 p54 和 p30 阻斷病毒-細胞相互作用對 ASFV 保護性免疫應答的相關性。用重組 p54 或p30蛋白免疫豬均可誘導產生中和抗體,并分別抑制病毒的吸附和內化。然而,免疫豬在致命感染中沒有得到保護,病程也沒有發生改變(只在p30免疫豬中觀察到發病的延遲)。相比之下,p54 和 p30 蛋白聯合免疫可以同時刺激病毒中和的兩種機制,并顯著改變了疾病的進程,提供了從延遲發病到完全阻斷病毒感染的不同程度的保護(Barderas et al., 2001;Gómez-Puertas et al., 1998)。為了評估桿狀病毒表達的來自另一致病性 ASFV 毒株(Pr4)p30、p54、p72 和 p22 蛋白在免疫保護中起的作用,用這些蛋白對豬進行免疫,但未能重現之前實驗中表現的保護力(Neilan et al., 2004)。盡管在試驗組動物中檢測到了 ASFV 特異性中和抗體,這些抗體的產生僅比臨床癥狀的出現延遲 2 天,并在感染后 2 天降低了病毒血癥水平。然而,到第4天,試驗組與未接種疫苗的對照組相比沒有顯著差異,動物在攻毒后 7 至 10天內死亡。免疫方案或病毒的差異可能影響結果。還需要進一步的研究建立最佳免疫方案并確定特定蛋白與抗體介導保護作用的真正相關性。

最后,桿狀病毒表達的 ASFV 血凝素表現出紅細胞吸附和凝集活性,這是病毒在巨噬細胞中誘導產生的CD2同源蛋白特征,免疫豬后造成血凝抑制并產生臨時感染抑制抗體。有趣的是,用這種重組蛋白免疫的豬可以抵抗致命性感染(Ruiz-Gonzalvo et al., 1996)。這使得有效亞單位疫苗的構成有了更多的可能性。

7. 針對 p54 蛋白動力蛋白結合域的抗體可以中和 ASFV

在感染初期,ASFV 通過結構蛋白 p54 與細胞質動力蛋白(一種基于微管的動力載體)的 8kda 輕鏈(DLC8)相互作用。這種相互作用對于病毒內化和轉移到細胞特定工作位點是至關重要的。p54 的一個 13個氨基酸(aa)結構域就足以與 DLC8 結合(Alonso et al., 2001)。自從 p54 動力蛋白結合域(DBD)被鑒定出來,并且成功用于細胞培養中的病毒感染抑制(Hernaez et al., 2010),我們探索了針對病毒該氨基酸序列的抗體如何干擾 ASFV 感染。

在該研究中,我們首先確定了感染環境下 DBD 氨基酸序列的免疫優勢。用人工合成的 ASFV DBD 肽段和病毒免疫豬血清,經 ELISA 對 DBD 序列的特異性抗體反應進行了評價,重組p54免疫豬血清也用于本實驗分析(圖5)。無論抗體效價是多少,所有血清均能識別p54蛋白,但只有病毒免疫豬血清可以在ELISA中與該 DBD 肽段反應。這一發現表明,產生針對DBD序列的特定抗體需要病毒在細胞內啟動復制過程。要獲得抗ASFV的保護作用,通常也需要有病毒復制。

圖 5 ELISA 檢測康復豬血清(6-9 號血清)和 p54 免疫豬血清(2-5 號血清)識別 ASFV DBD 的能力。包被蛋白為DBD肽段或純化的大腸桿菌表達的 p54 蛋白。

為了測試針對 DBD 的抗體抑制感染的潛力,我們制備了針對 DBD 的特異性抗體。由于多肽通常具有較低的免疫原性,我們將DBD的編碼序列與鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)2 型鞭毛蛋白(STF2)融合,STF2 是一種 TLR5 的配體,可以引起強烈的抗體免疫應答(Medzhitov et al., 1997)。該策略在過去曾成功地用于引起針對序列的抗體應答(Terron-Exposito et al., 2012)。以鼠傷寒沙門氏菌的 DNA 為模板,將 STF2 蛋白的ORF克隆到 Pfastbac (Invitrogen)中。產生的重組質粒 pFB-STF2-H-KDEL 包含 KDEL 序列和10個組氨酸殘基,分別用于促進蛋白的表達和純化。將ASFVp54蛋白中的 DLC8 結合域克隆到pFB-STF2-H-KDEL 中,與 STF2 共框,生成 pFB-STF2-DBD-H-KDEL 質粒。通過將 PCR 片段串聯克隆到pFBSTF2-H-KDEL 中,構建編碼四份DBD拷貝的 pFB-STF2-4xDBD-H-KDEL 載體(圖 6A)。為了優化蛋白表達,我們在感染粉紋夜蛾幼蟲(IBES®technology)之前在 sf21 細胞上驗證了重組蛋白的表達。按前述方法,從昆蟲幼蟲中提取總可溶性蛋白組分(Perez-Filgueira et al., 2006)。Western blot 檢測組氨酸標記的表達情況。該抗體識別出重組蛋白STF2、STF2-DBD 和 STF2-4xDBD 在預期電泳遷移率下的特異性條帶(圖6B)。從接種幼蟲中獲得的蛋白質在自然條件下純化,并用考馬斯亮藍染色鑒定(圖 6C)。

用純化的 STF2-DBD 融合蛋白免疫小鼠。每只小鼠接種 50μg 蛋白,分別添加了弗氏完全佐劑 (第一劑)或弗氏不完全佐劑(第二、三劑)。最后一次注射后 15 天,從脫纖維蛋白血中獲得多克隆血清,用ELISA滴定抗體效價。重組 STF2-4xDBD 免疫的所有小鼠(n = 5)有較強的免疫應答。只含 1 個 DBD 拷貝的重組融合蛋白免疫的小鼠的抗體應答水平各不相同,3 只與 STF2-4xDBD 免疫的有相同響應強度,2只免疫響應較弱(圖 7A)。

在蝕斑減少中和試驗中,檢測各組血清中在 Vero 細胞單層中非互補介導的病毒中和活性。免疫熒光的結果顯示,用 1 或 4 個 DBD 肽段免疫的小鼠血清,最多抑制 61.5%噬斑 (圖 7B 和 C)。在重復孔中計數蝕斑,取平均值,并與對照組血清中和法測得的蝕斑數進行比較。抗 STF2 血清沒有表現出任何中和活性。基于以上結果,我們可以推斷 p54 DBD 與抗體介導的病毒中和有關。然而,還需要進一步的實驗來確定誘導該區域抗體是否改變免疫豬的病程。

圖 6 用桿狀病毒表達系統表達含有 ASFV DBD 序列的鞭毛素融合蛋白。(A)圖像展示 STF2、STF2-DBD 和 STF2-4×DBD在桿狀病毒載體中的構建方法。3種構造均包含His標簽和KDEL序列并在桿狀病毒表達系統(Bac to Bac®;Invitrogen)中表達。(B)His 標簽抗體在 Western blot 中檢測 Sf21 昆蟲細胞中表達的重組 STF2(2)、STF2-DBD(3)和STF2-4×DBD(4)。從野生型桿狀病毒感染的昆蟲細胞中提取的蛋白作為陰性對照(1)。箭頭表示重組蛋白所在的位置。(C)經IBES®technology(T. ni 昆蟲用作生物工廠)獲得并純化的蛋白;STF2(5)、STF2-DBD(6)和 STF2-4×DBD(7)用 SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色法確定。

圖 7 (A)用包被了大腸桿菌表達并純化的 p54 蛋白的 ELISA 平板檢測免疫小鼠血清中對重組鞭毛素融合蛋白的免疫反應。血清系列梯度稀釋;小鼠分別免疫了 STF2(C1 和 C2)、STF2-DBD(B1-B5)和STF2-4×DBD(A1-A5)。血清中和效價用 1207 VR19 毒株(B)和 608 VR13(C)毒株測試。中和反應分析通過蝕斑中和減少實驗在Vero細胞上每個毒株接種100PFU來進行。

8. 結論

盡管最初的報告顯示,ASFV感染動物的血清缺乏中和活性,但在過去 15 年中,許多實驗室已經提供足夠的證據證明 ASFV 抗體具有中和活性。此外,一些設計巧妙的實驗揭示了抗體與抗病毒保護方面的相關性。然而,就抗體介導的中和而言,ASFV具有其他病毒也存在的一些不尋常特性。其中一些特性是某些作者得出ASFV不能誘導康復豬產生中和抗體的結論的原因。ASFV 的特點包括由于細胞傳代培導致病毒膜磷脂成分的改變和/或存在抑制完全中和的血清阻斷抗體。然而,毫無疑問,許多 ASFV 蛋白參與了在感染期間誘導中和抗體的過程,并被歸類到兩種中和機制之一中。此外,在 p72 和 p54 蛋白中也發現了中和過程中的一些關鍵表位。抗體介導的中和是對抗病毒感染的關鍵防御機制。盡管細胞介導的免疫機制可能像在其他感染巨噬細胞的病毒中一樣,對預防 ASFV 有重要作用。但目前的結果提示我們可以探究最大限度地誘導關鍵的和有效的中和抗體的疫苗配方。在 ASF 疫苗的設計中,應考慮加入刺激中和抗體產生的策略。


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